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原代細胞轉染的實用工具

作者:AJ真人生物 日期:2014-08-21 8:17:46 信息來源:/

原代細胞轉染的實用工具

生物通報道:現代分子生物學研究,很大程度上依賴於向細胞引入遺傳物質的能力。然而,要做到這一點並不那麽容易,尤其是在細胞緩慢分裂甚至不分裂的情況下。原代細胞就是這樣一個轉染難題,不過人們已經為此開發了許多趁手的工具。

瞬時轉染很有用

將核酸送入細胞主要有三條途徑。第一條途徑屬於化學方法,旨在減少帶負電的細胞對帶負電核酸的排斥,促使細胞膜通過胞吞、胞飲或融合攝入附著其上的顆粒。第二條途徑屬於物理方法,包括電穿孔、顯微注射和基因槍、磁轉染等等。第三條途徑是利用病毒(或類病毒顆粒)來遞送核酸,這一過程也被稱為轉導。轉導是將DNA轉入細胞並使之表達的一種保險的方法,這種方法對操作者有較高的專業要求,比較耗費時間,而且存在一定的生物安全性問題。

人們總是希望能夠獲得穩定表達目的基因或轉錄本的細胞係。然而就算一切順利,建立這種穩定細胞係也是一項很麻煩的工程。含有目的基因的DNA必須要進入細胞核,整合到宿主基因組中(或者成為自我複製的附加體episome),並由此得到轉錄和翻譯。

完成上述步驟可能需要六到八周,而後才能進行抗生素篩選,Altogen LabsCEO Dmitriy Ovcharenko說,該公司為用戶提供包各種臨床前的研究服務。正因如此,研究者們通常會先用瞬時轉染試一試自己的質粒載體,“一般在轉染後4872小時內就能看到蛋白表達,有時也會需要96小時,”Ovcharenko說。瞬時轉染可以幫助研究者們快速確定,細胞是否能夠很好的耐受質粒的編碼產物(蛋白甚至是miRNA)。

mRNAsiRNA送入細胞(替代DNA質粒),能夠快速嚐試轉錄本在細胞內的效果,特別適合研究那些不分裂或者難轉染的細胞,例如神經元和原代T細胞。盡管瞬時轉染的效果可能隻持續幾天,但RNA轉染起來要容易得多,因為它不需要進入細胞核就能夠發揮作用。(延伸閱讀:如何選擇siRNA轉染試劑)

穩定轉染的實用工具

要實現長期穩定表達,外源基因必須能夠留在宿主細胞中並且與之一同複製。要在原代細胞中達成這一目標,標準方法是使用電穿孔進行轉染。不過,各大公司也為這些難以轉染的細胞,提供了多種可以實現穩定轉染的試劑和試劑盒。

Promega公司的FuGENE® Life Technology公司的Lipofectamine®已經成為了通用轉染試劑中的經典。其他通用型產品也層出不窮,比如Incella公司的ScreenFect®AATCCTransfeX™。

許多公司還推出了專門為特定細胞類型量身打造的試劑和轉染方案。舉例來說,EZ Biosystems公司網站上列出了33種針對不同原代細胞的Avalanche™轉染試劑,從人動脈內皮細胞、尿道黏膜上皮細胞到小鼠胚胎成纖維細胞。Cell Applications公司的Cytofect™ 成纖維細胞轉染試劑盒,分別為原代的真皮、心髒和肺成纖維細胞提供了相應的優化方案。

“特別針對原代細胞的轉染試劑含有特殊的配方,而且經過了有針對性的測試和優化,能夠在維持細胞活力的同時提供最佳的轉染效率,”Bio-Rad公司的Teresa Rubio說。

不過,產品資料難免有自賣自誇之嫌,評估轉染試劑的效率和毒性最終還是得靠我們自己。沒有哪個轉染試劑是萬能的,因此實驗室裏最好能多做幾手準備。“事實上,人們對細胞轉染的生化機製還沒有足夠的理解,無法根據製定的細胞和應用預測哪個試劑最好用,”Incella公司的首席科學家Pavel Levkin坦陳。“因此,如果想要獲得最高的轉染效率,根據細胞類型進行優化是非常重要的。”

一步一步來

Ovcharenko建議我們在轉染原代細胞之前,先選擇一組轉染試劑進行優化和比較,可以是通用型試劑也可以是專門針對特定細胞的轉染試劑。“如果這些試劑的轉染效率都不理想,”他說。“那麽就應該嚐試一下電穿孔。”

市麵上形形色色的電穿孔儀也不少,也都配備了各種相應的試劑。有些係統(Lonza公司的Nucleofector™)使用專利的預設程序,其他則大多是開放式係統,允許用戶對一些參數進行編輯。

“從最終的功能上看,現在市麵上的電穿孔儀是非常相似的,”Thermo Fisher公司(最近收購了Life Technologies)負責轉染產品的James Lovgren說。關鍵在於如何設定最佳參數,“將核酸有效送入細胞,同時盡量減少對細胞的影響。隻有二者達到一定的平衡,細胞才能在電穿孔處理中存活下來。”

Alabama大學的Randy Cron教授用Nucleofector來轉染原代T細胞。這一係統可以在細胞質和細胞核的膜上打孔,他解釋道。這樣有利於把核酸送入細胞核,但也會影響到鈣離子流量,提高CD4+ T細胞活化標誌的表達。Cron提醒其他用戶在設計實驗和解讀結果時注意這一點。

如果電穿孔也無法達到足夠的轉染效率,“那就隻能用上我們最後的武器——病毒載體,”Ovcharenko說。雖然病毒遞送的效率最高,但這種方法需要大量的克隆和優化工作,還要采取相應的安全防護措施,其他方法都沒這麽麻煩。

在原代細胞中實現外源基因的長期穩定表達,一直是個很棘手的工程,但我們也不必因此而灰心喪氣。前輩們已經為此作了大量的工作,查查文獻和供應商提供的資料往往會讓我們獲益匪淺。

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