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細胞培養常見問題及解答

作者:AJ真人生物 日期:2013-09-05 15:26:20 信息來源:桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管之爆裂。

2、細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除DMSO?
除少數特別注明對DMSO敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之後,應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可,如此可避免大部分解凍後細胞無法生長或貼附之問題。

3、可否使用與原先培養條件不同之培養基?
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基,若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活。

4、可否使用與原先培養條件不同之血清種類?
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對於細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5、何謂FBS,FCS,CS,HS?
FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,FCS乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。

6、培養細胞時應使用5%或10%CO2?或根本沒有影響?
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩衝係統,而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7g時,細胞培養時應使用10%CO2;當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時,則應使用5%CO2培養細胞。

7、何時須更換培養基?
視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上之更換時間,按時更換培養基即可。

8、培養基中是否須添加抗生素?
除於特殊篩選係統中外,一般正常培養狀態下,培養基中不應添加任何抗生素。

9、附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度?應如何處理?
一般使用的trypsin-EDTA濃度為0.05% trypsin-0.53mM EDTA﹒4Na。第一次開瓶後應立即少量分裝於無菌試管中,保存於–20°C,避免反複冷凍解凍造成trypsin之活性降低,並可減少汙染之機會。

10、懸浮性細胞應如何繼代處理?
一般僅需持續加入新鮮培養基於原培養角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時,可將培養角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度,重複前述步驟即可。

11、欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?
欲回收動物細胞,其離心速率一般為300xg(約1,000rpm),5-10分鍾,過高之轉速,將造成細胞死亡。

12、細胞之接種密度為何?
依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13、細胞冷凍培養基之成份為何?
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意:由於DMSO稀釋時會放出大量熱能,故不可將DMSO直接加入細胞液中,必須使用前先行配製完成。

14、DMSO之等級和無菌過濾之方式為何?
冷凍保存使用之DMSO等級,必須為Tissueculturegrade之DMSO(如SigmaD2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶後應立即少量分裝於無菌試管中,保存於4°C,避免反複冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質,並可減少汙染之機會。若要過濾DMSO,則須使用耐DMSO之Nylon材質濾膜。

15、冷凍保存細胞之方法?
冷凍保存方法一:冷凍管置於4°C30~60分鍾→(-20°C30分鍾*)→-80°C16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。
冷凍保存方法二:冷凍管置於已設定程序之可程序降溫機中每分鍾降1-3°C至–80°C以下,再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20°C不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

16、細胞欲冷凍保存時,細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?
冷凍管內細胞數目一般為1x106cells/mlvial,融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜。

17、應如何避免細胞汙染?
細胞汙染的種類可分成細菌、酵母菌、黴菌、病毒和黴漿菌。主要的汙染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、汙染之血清和汙染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配製是減低汙染之最好方法。

18、如果細胞發生微生物汙染時,應如何處理?
加入相應抗生素。直接滅菌後丟棄之。

19、支原體(mycoplasma)汙染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?
不能。除極有經驗之專家外,大多數遭受支原體汙染的細胞株,無法以其外觀分辨之。

20、支原體汙染會對細胞培養有何影響?
支原體汙染幾乎可影響所有細胞之生長參數,代謝及研究之任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為mycoplasma-free,實驗結果之數據方有意義。

21、偵測出細胞株有支原體汙染時,該如何處理?
直接滅菌後丟棄,以避免汙染其它細胞株。

22、CO2培養箱之水盤如何保持清潔?
定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23、為何培養基保存於4℃冰箱中,顏色會偏暗紅色,且pH值會越來越偏堿性?
培養基保存於4℃冰箱中,培養基內之CO2會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾之CO2,以調整pH值。

24、各種細胞培養用的dish,flask是否均相同?
不同廠牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,製造程序亦不同,雖對大部分細胞沒有太大之影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。

25、購買之細胞冷凍管經解凍後,為何會發生細胞數目太少之情形?
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少,大都是因為離心過程操作上的失誤,造成細胞的物理性損傷,以及細胞流失。建議細胞解凍後不要立刻離心,應待細胞生長隔夜後再更換培養基即可。

26、購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因?
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳,常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍後,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置於–80°C太久。

27、收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?
冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋鬆動或鬆脫,乃因熱脹冷縮之物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞汙染,故冷凍管於放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊

28、如何選用特殊細胞係培養基?
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞,很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之,首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始,各種目的無血清培養最好首選AIMV(12005)培養基(SFM)。

 

29、L-穀氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?
L-穀氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基後,L-穀氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-穀氨酰胺在溶液中經過一段時間後會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-穀氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對於一些細胞具有毒性。

 

30、GlutaMAX-I是什麽?培養細胞如何利用GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?
GlutaMAX-I二肽是一個L-穀氨酰胺的衍生物,其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-穀氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定,即使在121磅滅菌20分鍾,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-穀氨酰胺幾乎完全降解。

 

31、什麽培養基中可以省去加酚紅?
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由於酚紅幹擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

 

32、培養基中丙酮酸鈉的作用是什麽?
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向於以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

 

33、目錄上說,Hank‘s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養箱。原因是什麽?Hank’s平衡鹽溶液(HBS)和Earle‘s平衡鹽溶液(EBS)有什麽本質的功能差別?
HBS和EBS的主要差別在於碳酸氫鈉的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中,溶液會變堿,Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織,需要用Eagles液,。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用Hanks液就可以了。

 

34、二價離子抑製胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什麽?
二價離子的確抑製胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合遊離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑製胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用EDTA清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。

 

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