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石蠟切片免疫組化染色步驟

作者:AJ真人生物 日期:2013-09-30 10:19:33 信息來源:/

石蠟切片免疫組化染色步驟


1、載玻片的處理:
抗原修複過程中,由於高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響,極易造成脫片。為保證試驗的正常進行,可選用AJ真人提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑,對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下:

1.1 APES:現用現配。將洗淨的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中,停留20~30秒鍾,取出稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES,置通風櫥中晾幹即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位,並盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結果。

1.2 HistogripTM:將洗淨的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中,停留1~2分鍾,然後用雙蒸水快速清洗三次,室溫幹燥或60oC烤箱烘烤一小時,裝盒備用。

1.3 Poly-L-Lysine:將洗淨、幹燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡5分鍾,60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜幹燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃製品。

 

2、常用酶消化:
2.1 胰蛋白酶:一般使用濃度為0.05%~0.1%,消化時間為37℃、10~40分鍾,主要用於細胞內抗原的顯示。

2.2 胃蛋白酶:一般使用濃度為0.4%,消化時間為37℃、30~180分鍾,主要用於細胞間質抗原的顯示,如:Laminin(層粘蛋白),Collagen IV(IV型膠原)等。

2.3 皂素(Saponin):一般使用濃度為2~10?g/ml的saponin溶液,消化時間為室溫孵育30分鍾。

 

3、抗原熱修複:
可根據實驗室的具體條件,選用微波爐抗原修複、高壓鍋抗原修複或水浴高溫抗原修複。抗原熱修複可選用各種緩衝液,如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等,但實驗證明,以0.01M枸櫞酸鹽緩衝液(pH6.0)效果最好。請選用AJ真人提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩衝液(粉劑)配製,取該粉劑一包溶於1000ml的蒸餾水中,混勻,其pH值在6.0 ± 0.1,如因蒸餾水本身造成的pH值偏差,請自行調整。

3.1 石蠟切片微波爐抗原修複操作方法:切片脫蠟至水後,3%H2O2處理10分鍾,蒸餾水洗2分鍾×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩衝液(工作液)的容器中,置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間並持續10~15分鍾(注意:無論是使用醫用或家用微波爐,請根據具體機型酌情設置條件,務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求)。取出容器,室溫冷卻10~20分鍾(注意:不可將切片從緩衝液中取出冷卻,以便使蛋白能夠恢複原有的空間構型)。PBS洗,下接免疫組化染色步驟。

3.2 石蠟切片高壓抗原修複操作方法:切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩衝液(工作液)注入不鏽鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置於金屬架上,放入鍋內,使切片位於液麵以下,蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鍾後),計時1~2分鍾,然後將壓力鍋端離熱源,冷水衝至室溫後,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗後,PBS洗2分鍾×3,下接免疫組化染色步驟。

3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修複操作方法:切片脫蠟至水後,放入盛有枸櫞酸鹽緩衝液(工作液)的容器中,並將此容器置於盛有一定數量自來水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鍾,然後端離電爐,室溫冷卻20~30分鍾,蒸餾水衝洗,PBS洗,下接免疫組化染色步驟。


4、免疫組化染色步驟:
(以美國ZYMED公司SP試劑盒為例)
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鍾,以消除內源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水衝洗,PBS浸泡5分鍾,(如需采用抗原修複,可在此步後進行)。
5~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10分鍾。傾去血清,勿洗,滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
PBS衝洗,5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗(1%BSA-PBS稀釋),37℃孵育10~30分鍾;或滴加第二代生物素標記二抗工作液,37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS衝洗,5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈黴卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10~30分鍾;或第二代辣根酶標記鏈黴卵白素工作液,37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS衝洗,5分鍾×3次。
顯色劑顯色(DAB或AEC)。
自來水充分衝洗,複染,封片。

冰凍切片免疫組化染色步驟
冰凍切片4~8mm,室溫放置30分鍾後,入4℃丙酮固定10分鍾,PBS洗,5分鍾×3。用3%過氧化氫孵育5~10分鍾,消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗,5分鍾×2。
下接免疫組化染色操作步驟。

 

 

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